Méthodes d’étude des antibiotiques

Les antibiotiques sont des substances d’origine biologique ou synthétique capable d’inhiber la multiplication des bactéries. Ce sont des médicaments d’usage courant qui constituent un arsenal thérapeutique important pour traiter les infections bactériennes. Leur évaluation expérimentale se fait par le biais de méthodes d’études qui sont schématiquement de trois sortes, in vitro, in vivo et clinique. Les méthodes d’études in vitro sont nombreuses et peuvent aller de la simple détermination de la CMI à la modélisation des courbes de concentration plasmatique. Les modèles animaux sont une reproduction de l’infection sur des prototypes animaux, les infections reproduites couramment sont, l’endocardite, la méningite et la pneumopathie. L’évaluation clinique répond à la conception et la méthodologie des essais cliniques en général avec quelques particularités.

Méthodes d’étude in vitro :
Modèles statiques :
• Détermination de la CMI
La méthode la plus simple pour évaluer la sensibilité bactérienne à un antibiotique consiste à analyser la réponse d’une culture bactérienne à une concentration fixe de l’antibiotique. Cette méthode statique permet de déterminer deux paramètres fondamentaux, la CMB, définie par la plus faible concentration en agent capable d’entraîner la mort d’au moins 99,99 % des bactéries d’un inoculum (< 0,01% de survivants) et la CMI définie par la concentration de l’antibiotique la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée.

- Les méthodes de dilution
Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d’antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2.
En milieu liquide, l’inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l’antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d’antibiotique et où aucune croissance n’est visible.
En milieu solide, l’antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Pétri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (un inoculateur à têtes multiples, appareil de Steers, permet d’ensemencer de 20 à 30 souches différentes par boîte). Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l’inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d’antibiotique. La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2 (ou de raison 1,25), est la méthode de référence.
Les techniques de dilution en milieu gélosé permettent également de mesurer la concentration inhibitrice 99 % (concentration qui inhibe la croissance de 99 % des cellules d’une souche bactérienne) ou la concentration inhibitrice 50 % (concentration qui inhibe la croissance de 50 % des cellules d’une souche bactérienne). Les déterminations des concentrations inhibitrices 99 % et 50 % sont plus précises que la détermination des CMI puisque les écarts-types moyens sont respectivement de 0,3 log2 base 2 et de 0,07 log2 contre 0,7 log2 pour la CMI.

- Les méthodes de diffusion : antibiogramme standard
Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la surface d’un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l’application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques s’entourent de zones d’inhibition circulaires correspondant à une absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d’inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe.
À la limite des zones d’inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d’antibiotiques égales aux CMI. Les méthodes de diffusion ne permettent pas de chiffrer directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d’inhibition et les log2 des CMI mesurées par les techniques de dilution. Ces relations, appelées droites de concordance ou droites de régression qui ont été établies par des laboratoires spécialisés travaillant dans des conditions standardisées.
Une droite de concordance (ou droite de régression) est une relation linéaire (droite d’ajustement optimal) existant entre les logarithmes en base 2 des CMI (calculées par une technique de dilution) et les diamètres des zones d’inhibition mesurés autour de disques contenant une dose connue d’un antibiotique. Les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés par une technique de diffusion en gélose.
Ces droites sont tracées expérimentalement à l’aide de nombreuses souches. En général, on utilise un minimum de 100 souches appartenant au moins à quatre genres bactériens différents. Une droite de concordance n’est valable que pour un disque contenant une quantité déterminée d’un antibiotique donné.

- Autres méthodes : le E–test :
L’E–test permet de déterminer la CMI grâce à l’utilisation de bandelettes imprégnées d’un gradient exponentiel continu de l’antibiotique à tester. Ce gradient couvre une zone qui, en fonction des molécules, va de 0,016 à 256 mg/L ou de 0,002 à 32 mg/L. Le E–test associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la surface d’un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche à étudier. Après incubation, l’inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d’inhibition dont les points d’intersection avec la bandelette définissent la CMI. Une échelle de lecture, imprimée sur la bandelette, permet une interprétation rapide.

• Détermination de la CMB :
La CMB est déterminée après une recherche de CMI en milieu liquide (technique de macrodilution ou de microdilution). La technique consiste à ensemencer sur un milieu gélosé dépourvu d’antibiotique, une quantité définie de tous les tubes ne présentant pas de croissance visible et à dénombrer les bactéries survivantes. Ce nombre est comparé au nombre de bactéries initialement présentes dans l’inoculum.

• Etude de la synergie :
La synergie est appréciée en mesurant l’activité bactéricide de deux antibiotiques à temps fixe, en 24 heures ou à temps variable, en cinétique.
À temps fixe, la technique de l’échiquier est la plus complète. Elle consiste à étudier différentes concentrations de deux antibiotiques seuls et associés. Les résultats sont exprimés d’une part pour la bactériostase par le FIC index (fractional inhibitory concentration index) et d’autre part pour la bactéricidie par le FBC index (fractional bactericidal concentration index). Le même calcul est effectué pour déterminer le FBC. Une association est synergique si ces index sont < 0,5, antagoniste s’ils sont > 2.
La technique du triangle, une seule concentration d’antibiotiques est choisie pour chaque antibiotique ; elle est déterminée par la concentration sérique moyenne obtenue avec des posologies habituelles. Cette technique permet l’étude de plusieurs antibiotiques et de leurs associations deux par deux selon un schéma triangulaire. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survivants pour chaque antibiotique seul et pour les différentes associations : les associations bactéricides correspondent à celles ne laissant pas plus de 0,01 % de survivants.
À temps variable, les interactions entre antibiotiques peuvent être étudiées en cinétique. Des courbes de bactéricidie sont tracées en exposant les bactéries à 2 antibiotiques seuls et associés.

Modèles dynamiques :
À la différence des modèles statiques, les modèles dynamiques consistent à exposer la bactérie à une concentration variable de l’antibiotique mimant ainsi la clairance in vivo. Le modèle le plus classique consiste à infuser un bouillon sans antibiotique dans l’inoculum à l’aide d’une pompe péristaltique de telle sorte à avoir une diminution de la concentration de l’antibiotique semblable à la clairance in vivo. Cette approche correspond au modèle pharmacocinétique monocompartimental.
Ultérieurement des modèles bicompartimentaux se sont développés, plus proche à la pharmacocinétique in vivo que les monocompartimentaux.
Plusieurs dispositifs ont été confectionnés pour répondre à ce modèle, le dispositif le plus commun correspond à un tube dit central doué de pores d’efflux et d’afflux permettant l’échange du milieu. Ce tube correspond au sérum. Un autre tube est inséré au sein du tube central correspondant aux tissus hébergeant l’infection, ce tube est dit périphérique. Les deux tubes sont séparés par une membrane de dialyse.
Une dilution de l’inoculum faite en bouillon de Mueller-Hinton est introduite dans le compartiment périphérique simulant ainsi l’infection, le même bouillon dépourvu de l’antibiotique est placé près du compartiment central. La membrane de dialyse doit être perméable aux solutés et imperméable aux bactéries. Au début de l’expérimentation l’antibiotique est présent à des concentrations élevées au niveau des deux compartiments, par la suite un milieu frais est pompé au niveau du compartiment central, la concentration décroît ainsi au niveau des deux compartiments.

Méthodes d’étude expérimentales :
Les modèles expérimentaux in vivo correspondent à une reproduction de l’infection chez des espèces animales. Divers informations et paramètres peuvent être identifiés dans l’évaluation d’un antibiotique par l’intermédiaire des modèles expérimentaux animaux.
Les modèles non discriminants d’infection de cuisse ou de poumon de souris permettent de déterminer le paramètre pharmacocinétique–pharmacodynamique prédictif de l’activité in vivo et de donner des recommandations sur les modalités optimales d’administration chez l’homme. Ces modèles peuvent également définir précisément les concentrations critiques classant les souches bactériennes en sensibles ou résistantes en fonction des résultats obtenus in vivo. Dans l’évaluation d’une nouvelle molécule antibiotique, des modèles plus discriminants comme l’endocardite, l’ostéite, la pneumopathie ou la méningite expérimentale peuvent être utilisés pour comparer l’activité antibactérienne à celle d’un traitement de référence et étudier la diffusion tissulaire. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Enfin, l’approche expérimentale reste la plus fine pour étudier l’intérêt potentiel et le mécanisme du bénéfice d’une association d’antibiotiques ou d’une association à un traitement non antibiotique.
Les méthodes de reproduction de l’infection chez l’animal diffèrent d’un modèle à un autre. À titre d’exemple, l’endocardite bactérienne du lapin est réalisée dans un premier temps par l’introduction d’un cathéter par voie carotidienne rétrograde jusqu’au contact de l’orifice aortique, ou par voie jugulaire pour induire des lésions de l’appareil valvulaire droit, vingt-quatre heures plus tard, le cathéter est laissé en place et un inoculum bactérien calibré est injecté par voie veineuse périphérique. La bactérie se développe sur la lésion préexistante et l’infection progresse plus ou moins rapidement selon la taille de l’inoculum et la virulence de la souche bactérienne. Ces facteurs affectent aussi la sévérité de la maladie qui peut être appréciée par le taux de mortalité et le délai moyen pour observer 50 % de la mortalité. L’endocardite expérimentale est considérée comme un modèle d’infection sévère à granulopénie locale, compte tenu de la très forte densité bactérienne par gramme de végétation (entre 107 et 109 unités formant colonie par gramme de végétation, UFC/g) et de la rareté de cellules à activité phagocytaire dans les parties les plus profondes de la lésion.
Les deux principaux points critiques de l’extrapolation des résultats obtenus avec les modèles expérimentaux à l’homme sont, d’une part, le type de l’infection obtenue souvent non physiopathologique, mode d’inoculation artificiel, inoculum bactérien élevé favorisant ou défavorisant certaines classes d’antibiotiques, infection d’évolution trop rapide, fulminante, imposant de débuter l’antibiothérapie trop précocement, et d’autre part, les différences pharmacocinétiques entre l’homme et les petits animaux expérimentaux ou l’élimination des antibiotiques est trop rapide.
Un exemple illustrant la difficulté de l’extrapolation des résultats animaux chez l’humain est celui des modèles expérimentaux de choc septique ou endotoxinique qui ont été mis au point pour permettre l’évaluation de divers traitements symptomatiques. Une analyse récente très pertinente indique que ces modèles n’arrivent pas à reproduire la complexité de la physiopathologie du choc septique chez l’homme, et produisent des résultats très variables, rendant l’extrapolation des données animales très difficile chez l’homme.

Évaluation clinique :
Les essais cliniques en matière d’antibiotique diffèrent des autres thérapeutiques dans plusieurs points, ce qui rend la recherche clinique particulière et complexe dans ce domaine. Le traitement d’une infection bactérienne sollicite l’interaction de trois paramètres, la bactérie, l’hôte et l’antibiotique. Cette interaction triple affecte la méthodologie de conception, d’analyse et d’interprétation des résultats. Deux éléments doivent être pris en compte dans l’évaluation de l’efficacité, le critère clinique et le critère bactériologique.

Critères d’inclusion :
Ils conditionnent la pertinence et la qualité de la définition des infections choisies pour démontrer l’efficacité du produit. Le risque ici est en effet, de ne pas disposer pour apprécier l’efficacité du produit dans certaines indications que d’études incluant un grand nombre de malades mal définis. À titre d’illustration, dans le cas des infections respiratoires basses, les bronchites aiguës ne sont pas convenables pour juger l’efficacité du produit, il faut choisir des pneumopathies d’allure bactérienne ou des exacerbations de BPCO bien définies. Dans les infections cutanées, il faut exclure les pathologies de colonisation, les pathologies de guérison spontanée et les pathologies chirurgicales.

ÉVALUATION de la réponse thérapeutique :
Les critères de jugements sont bactériologiques et/ou cliniques. Le choix de critères de jugements bactériologiques est plus pertinent pour un certain nombre d’infections. D’autres critères sont parfois nécessaires mais doivent être minutieusement définis par le protocole afin de ne pas conduire à des biais.

• ÉVALUATION clinique :
La réponse clinique doit être définie en tenant compte du site de l’infection, de la maladie et de la sévérité du processus, elle exigera des critères cliniques, biologiques et d’autres paramètres paracliniques. La définition de la réponse au traitement doit être binaire, réponse ou non réponse. Les termes intermédiaires comme amélioration et réponse partielle sont difficiles à définir et souvent inadéquatement interprétés pour démontrer une réponse réelle au cours de l’analyse d’un essai.

• ÉVALUATION microbiologique
L’évaluation microbiologique est un critère de mesure objectif de la réponse, cependant les conditions de collecte et de transport des isolats, les outils d’identification du germe et leur interprétation, peuvent être considérés à tort correctes et conformes aux normes.

Étapes de l’évaluation clinique
Phase I
La phase I permet d’avoir des informations initiales sur la tolérance et la pharmacocinétique des antibiotiques. Habituellement cette phase est conduite chez des sujets saints. Les enfants et les femmes enceintes sont exclus de la phase I sauf dans des situations particulières ou leur inclusion s’impose, contexte ou les infections opportunistes sont favorisées (ex : HIV), ou toute autre infection sérieuse pouvant survenir chez la femme enceinte ou l’enfant.
Le profil pharmacocinétique est déterminé par les études à dose unique puis par celles aux doses multiples. Des prélèvements sanguins et urinaires sont effectués, la concentration de l’antibiotique y est calculée par des méthodes appropriées. La demi-vie, le volume de distribution, la clairance totale, la clairance rénale sont ensuite calculés. Les études de phase I doivent inclure les interactions médicamenteuses et alimentaires.
Le passage cérébro-méningé doit être étudié chez des patients dont les méninges sont atteintes et recevant un traitement approuvé pour l’atteinte méningée. Alternativement ce passage peut être étudié chez des patients dont les méninges sont intactes et vont subir une ponction lombaire pour événement quelconque. Avant d’effectuer ces tests l’antibiotique expérimental ne doit pas avoir démontré la potentialité d’interférer avec l’antibiotique utilisé pour le traitement de l’affection en cours.

Phase II
Les études de phase II donnent des informations complémentaires sur le profil pharmacocinétique et la tolérance du nouvel antibiotique. Les études de phase II sont menées chez des patients hospitalisés ou ambulatoire, dénués de toute affection grave. Les mêmes standards concernant l’adhérence au protocole et concernant la surveillance de la tolérance et l’efficacité exigée pour les essais cliniques sont applicables aux antibiotiques.
Le protocole de la phase II doit préciser les procédures exigibles pour identifier la bactérie, les tests de sensibilité et la méthode quantification de la bactérie.

Phase III
Les études de phase III sont des études de grande envergure menées chez des patients. Elles sont menées après l’évidence de l’efficacité thérapeutique démontrée à la phase II. Autant que possible les études comparatives doivent utiliser plus qu’un comparateur. En plus de la supériorité de l’efficacité thérapeutique par rapport à d’autres thérapeutiques, les études de phase III peuvent apporter des informations sur les interactions médicamenteuses. La population recrutée inclut les enfants, les sujets âgés, les insuffisants hépatiques, les insuffisants rénaux, les sujets ayant une pathologie concomitante et les sujets prenant des médicaments pouvant interagir avec la pharmacocinétique de l’antibiotique.

Les antibiotiques sont des médicaments dont la pharmacodynamie est particulière, du fait que leur cible thérapeutique est un micro-organisme exogène ne faisant pas partie stricto sensu de l’organisme. Il en est ainsi pour leur évaluation qui est complexe du fait qu’elle tient compte de trois paramètres, l’antibiotique, l’hôte et la bactérie. Les techniques et les modèles d’évaluation actuels sont loin d’être puissants, en raison de l’incertitude de leurs résultats. Le développement de méthodes mieux adaptées et plus rigoureuses est vivement recommandé.
Ainsi trois groupes de propositions pour optimiser le développement de futures molécules peuvent être considérés :
• Affiner les données de sécurité préclinique pour une meilleure prédiction de l’activité et surtout de la tolérance ;
• Améliorer les performances et l’organisation des essais cliniques, ce qui supposerait de reconsidérer certaines règles méthodologiques
• Intégrer dans le dossier d’évaluation des éléments pertinents, nouveaux, mesurant l’activité antibactérienne, en prenant en compte les résistances actuelles et tâchant de prédire celles qui sont à venir.

Références :
1. Les modèles expérimentaux animaux peuvent-ils contribuer à la bonne utilisation des antibiotiques ?
Antibiotiques, In Press, Corrected Proof,
G. Potel, C. Jacqueline, J. Caillon, G. Amador Del Valle, E. Batard
2. Évaluation des antibiotiques dans des modèles expérimentaux animaux : apports et limite
Réanimation Urgences, Volume 8, Issue 2, May 1999, Pages 121-122
J.P. Bédos
3. The Design of Clinical Trials with Antibiotics European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, July 1990,p. 523-529 ; V ol. 9, No. 7. S. R. Norrby
4. Clinical evaluation of a new broad-spectrum oxa-beta-lactam antibiotic, moxalactam, in neonates and infant
The Journal of Pediatrics, Volume 98, Issue 1, Pages 129-136
P. Lietman, U. Schaad, G. McCracken, Jr., N. Threlkeld, M. Thomas
5. Antibiotic clinical trials revisited
Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2000) 46, 651-65 F. Baquero, R. Bax, and I. Phillips

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